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凝胶色谱柱的使用方法


凝胶色谱柱的使用方法大体有一下步骤:
(1)预处理称取葡聚糖凝胶(有不同型号)若干克,加入洗脱剂(通常为甲醇或者水,这里以甲醇为例)约20倍凝胶量,置室温下3h进行溶胀,溶胀必须彻底,否则会使上柱后流速变慢,凝胶断裂等。
(2)装柱凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为1:15。柱的底部用装有细玻璃管的橡皮塞塞紧,用洗净的玻璃丝(约200目尼龙布)垫底或购买类似规格的商品柱。然后将柱垂直安装好,接着将溶胀好的凝胶边搅匀边缓缓连续装入,色谱柱的出口流速m维持在5~10ml/min。凝胶颗粒沉积到柱底后关紧色谱柱,等沉降到1-2cm时再2打开色谱柱。直至降到满意高度为止,等凝胶柱内的液体留的与凝胶高度差不多时,用较小的滤纸盖住凝胶床表面,再用洗脱剂洗脱过夜。装柱后的凝胶必须均匀,不能有气泡或明显条纹。否则,必须到出重装。
(3)加样装好的色谱柱至少要用相当于3倍保留体积的洗脱剂平衡,待洗脱剂流至与凝胶柱液面相平时(不能流干,否则会带入气泡),用滴管吸取样品溶液,在高于凝胶表面约1cm处,沿管壁四周缓缓滴加样品液,加完后打开下面的出口,使样品渗入凝胶内。再关闭出口,用少量洗脱液将管壁残留的样品洗下,再打开出口,至溶液渗入柱内,再关闭出口。可以考虑再加一层薄薄的脱脂棉以保护柱表面(我一般不加),然后即可进行洗脱。
(4)洗脱与收集洗脱时,用甲醇作洗脱剂,并且要连续不断地进行,使凝胶柱上端保持一定的液层,防止凝胶柱表面的液体流干。一般酸性洗脱剂中碱性物质容易洗脱,碱性洗脱剂中酸性物质容易洗脱。多糖类物质等极性大的物质考虑用水洗脱,常用的洗脱剂是水-甲醇,水-乙醇,水-丙酮等,一般根据自己样品的性质选择洗脱液,洗脱液可一直用单一梯度。凝胶色谱的共性是流速慢,每份一般体积较小。(内径1.3cm左右,长80cm左右的柱子我一般每份收集液为8ml)
(5)凝胶的再生和回收凝胶柱多次使用后,若污染严重,则考虑用50度左右的2%的NaOH和0.5mol/LNaCl混合液浸泡后,再用水洗净即可。

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